Protease merupakan enzim yang mengkatalisis pemutusan ikatan peptida pada protein. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi, mengkarakterisasi dan menentukan aktinobakteri yang mampu menghasilkan enzim protease. Metode pengambilan sampel pada penelitian ini dilakukan dengan purposive sampling pada suhu 50, 60 dan 70 oC. Isolasi aktinobakteri termofil dilakukan pada media Humic Acid Vitamin B Agar (HV), karakterisasi morfologi dengan menggunakan media Yeast Malt Agar (YMA), Yeast Starch Agar (YSA), Oatmeal Agar (OA) dan dilakukan karakterisasi mikroskopis aktinobakteri serta pengukuran luas diameter zona bening yang terbentuk pada media susu skim. Hasil isolasi aktinobakteri yang diperoleh adalah satu isolat pada suhu 50 oC dan lima isolat pada suhu 60 oC, sedangkan pada suhu 70 oC tidak didapatkan isolat aktinobakteri. Dari enam isolat yang didapatkan, Empat diantaranya mampu menghasilkan enzim protease. Nilai Indeks Proteolitik (IP) tertinggi diperoleh dari isolat ATIS01 yaitu 3,8. Proteases are enzymes that catalyze the breakdown of peptide bonds in proteins. In this study aims to isolate, characterize and determine actinobacteria that are capable of producing protease enzymes. The sampling method in this study was conducted by purposive sampling at temperatures of 50, 60 and 70 oC. Isolation of thermophilic actinobacteria was carried out on Humic Acid Vitamin B Agar (HV) media, morphological characterization was performed using Yeast Malt Agar (YMA), Yeast Starch Agar (YSA), Oatmeal Agar (OA). Measurement of clear zone diameter formed on skim milk media. There were one isolate at a temperature of 50 oC and five isolates at a temperature of 60 oC, whereas at 70 oC no actinobacterial isolate was recovered. Of the six isolates obtained, four of them were able to produce protease enzymes. The highest Proteolytic Index (IP) value which was obtained from ATIS61 isolate 3,8.