Protease merupakan enzim yang mengkatalisis pemutusan ikatan peptida pada protein. penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi, mengkarakterisasi dan menentukan aktinobakteri yang mampu menghasilkan enzim protease. metode pengambilan sampel pada penelitian ini dilakukan dengan purposive sampling pada suhu 50, 60 dan 70 oc. isolasi aktinobakteri termofil dilakukan pada media humic acid vitamin b agar (hv), karakterisasi morfologi dengan menggunakan media yeast malt agar (yma), yeast starch agar (ysa), oatmeal agar (oa) dan dilakukan karakterisasi mikroskopis aktinobakteri serta pengukuran luas diameter zona bening yang terbentuk pada media susu skim. hasil isolasi aktinobakteri yang diperoleh adalah satu isolat pada suhu 50 oc dan lima isolat pada suhu 60 oc, sedangkan pada suhu 70 oc tidak didapatkan isolat aktinobakteri. dari enam isolat yang didapatkan, empat diantaranya mampu menghasilkan enzim protease. nilai indeks proteolitik (ip) tertinggi diperoleh dari isolat atis01 yaitu