Bakteri asam laktat merupakan bakteri Gram positif yang menghasilkan asam laktat dari proses fermentasi karbohidrat. Bakteri asam laktat telah digunakan dalam pengolahan bahan pangan karena mampu menghambat pertumbuhan bakteri patogen dan pembusuk makanan. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi bakteri asam laktat isolat BK-02 asal daging kerbau (Bubalus bubalis) secara fenotipik dan genotipik, serta mengetahui pengaruh aktivitas ekstrak bakteriosin kasar terhadap bakteri patogen. Tahapan dari penelitian ini meliputi regenerasi isolat pada media de Man Rogosa and Sharpe Agar (MRSA). Kemudian dilakukan identifikasi fenotipik dengan pewarnaan Gram, uji katalase, dan uji kit API 50 CHL. Lalu dilakukan identifikasi genotipik yang terdiri dari isolasi DNA menggunakan QIAmp DNA Mini Kit (Qiagen), uji kualitas DNA menggunakan elektroforesis, amplifikasi gen 16S rRNA menggunakan primer Bact 27F dan UniB 1492R, uji kualitas hasil amplifikasi, sequencing gen 16S rRNA, dan konstruksi pohon filogenetik. Selanjutnya dilakukan uji aktivitas antimikroba ekstrak bakteriosin kasar isolat BK-02 terhadap bakteri patogen. Hasil identifikasi secara fenotipik dengan kit API 50 CHL menunjukkan bahwa isolat BK-02 teridentifikasi sebagai Lactococcus raffinolactis dengan nilai akurasi yang rendah yaitu 15,7%, sedangkan secara genotipik, isolat BK-02 teridentifikasi sebagai Streptococcus bovis strain JB1 dengan nilai bootstrap sebesar 66%. Hasil uji aktivitas antimikroba ekstrak bakteriosin kasar menunjukkan bahwa isolat BK-02 mampu menghambat pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus dengan nilai rata-rata diameter zona hambat sebesar 7,3 mm dan tidak memiliki daya hambat terhadap bakteri Escherichia coli. Kata kunci: Bakteri asam laktat, fenotipik, genotipik, bakteriosin, sequencing, gen 16S rRNA, pohon filogenetik.