Abstrak. Gelatin merupakan suatu jenis protein yang diperoleh dari hidrolisis parsial kolagen. Gelatin juga merupakan produk alami yang larut dan bisa bersifat sebagai gelling agent (bahan pembuat gel) atau sebagai non gelling agent. Hewan yang menjadi sumber gelatin terbesar saat ini adalah babi dan kulit sapi, yaitu 46% dan 29,4% dari produksi gelatin dunia. Sumber gelatin yang tidak halal menjadi permasalahan bagi umat muslim di dunia, sehingga perlu dicari sumber lain yang halal dan dapat diterima oleh semua agama. Ikan tuna (Thunnus sp.) merupakan salah satu sumber yang potensial untuk dijadikan bahan baku alternatif pembuatan gelatin dan merupakan jenis ikan yang banyak dihasilkan perairan Indonesia. Penelitian ini bertujuan untuk mengoptimasi pembuatan gelatin dari kulit dan sisik ikan tuna (Thunnus sp.) hingga dihasilkan gelatin dengan mutu yang baik. Penelitian dilakukan dengan 3 variabel independen (bebas) yaitu [NaOH] (A), [asam sitrat] (B) dan suhu ekstraksi (C) yang akan diuji pada 5 level (-α, -1, 0, 1, α) berbeda. Variabel dependen (respon) yang dianalisis dalam penelitian ini adalah rendemen, kekuatan gel, viskositas, aktivitas emulsi, kapasitas busa, pH, kadar air, kadar abu dan kadar protein. Berdasarkan hasil penelitian diperoleh nilai rendemen berkisar 16,9-25,6%, kekuatan gel berkisar 259,50-389,83 g Bloom, viskositas 1,53-2,57 cP, aktivitas emulsi berkisar 21,68-40,62 m2/g, kapasitas busa berkisar 80-280%, pH berkisar 3,80-4,70, kadar air berkisar 4,05-12,68%, kadar abu 2,20-5,05% dan kadar protein berkisar 71,79-83,88%. Proses optimasi selanjutnya dilakukan menggunakan formulasi yang direkomendasikan sebagai solusi optimum ekstraksi yaitu [NaOH] 0,15%, [asam sitrat] 1% dan suhu ekstraksi 50oC dan menghasilkan gelatin dengan nilai rendemen 24,48%, kekuatan gel 252,33 g Bloom, viskositas 2,6 cP, aktivitas emulsi 37,67 m2/g, kapasitas busa 136,67%, pH 4,26 kadar air 3,9% , kadar abu 1,04%, dan kadar protein 75,79%. Kata kunci : Gelatin, ikan tuna, optimasi, rendemen gelatin.