Keamanan penggunaan tumbuhan pasak bumi (Eurycoma longifolia. Jack) belum diketahui. Penelitian ini bertujuan untuk menguji toksisitas akut ekstrak akarnya dengan menilai dosis letalis50 (LD50), perkembangan berat badan, gejala-gejala toksisitas dan profil makroskopis organ vital tikus putih. Penelitian eksperimental laboratorik ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap dengan “post-test only with control group design”. Tiga puluh ekor tikus putih (Rattus norvegicus) jantan dan betina, galur Wistar, umur ± 3 bulan, berat badan ± 200 g dibagi atas 5 kelompok (n=6). Ekstrak diberikan 1 ml per 200 g berat badan, secara oral dengan dosis tunggal 0, 25, 75, 225 dan 675 mg/ml. Nilai LD50 dihitung berdasarkan metode Weil.CS, perkembangan berat badan menggunakan Analisis Varians satu arah (α=0,05) dan uji Beda Nyata Terkecil (BNT). Gejala-gejala toksisitas dan profil makroskopis organ vital tikus putih dianalisis secara kualitatif. Hasilnya menunjukkan bahwa ekstrak akar pasak bumi tidak toksik (LD50=7498,94 mg/kg BB). Perkembangan berat badan tikus putih terjadi pada dosis, 25, 75 dan 225 mg/ml, sedangkan perilaku menunjukkan potensi toksisitas semakin meningkat dengan peningkatan dosis, kecuali pada aktivitas lokomotor yang mengalami penurunan setelah 3 – 6 jam pemberian ekstrak tersebut. Gejala-gejala toksisitas akibat pemberian ekstrak akar pasak bumi terlihat pada dosis 225 dan 675 mg/ml berupa depresi, pernafasan dangkal, konvulsi, koma dan kematian. Perubahan profil makroskopis organ vital tikus putih terjadi pada dosis tinggi (675 mg/ml) berupa perbesaran pada lambung, hati dan otak. Perubahan warna menjadi lebih gelap terjadi pada ginjal dan hati, sedangkan bercak-bercak putih terjadi pada paru. Kata Kunci : Toksisitas akut, akar pasak bumi, antimalaria, afrodisiak