Staphylococcus aureus merupakan bakteri penyebab penyakit infeksi. Tanaman Asam Jawa (Tamarindus Indica Linn) secara empiris digunakan sebagai antibakteri. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui daya hambat ekstrak daun asam jawa terhadap pertumbuhan S.aureus secara in vitro. Penelitian ini menggunakan eksperimen laboratorium dengan Rancangan Acak Lengkap (RAL) yang terbagi dalam 6 kelompok yaitu 4 kelompok perlakuan dan 2 kelompok kontrol dengan pengulangan sebanyak 6 kali. Kelompok perlakuan terdiri dari ekstrak daun asam jawa masing-masing dengan konsentrasi 25%, 50%, 75%, dan 100%. Kelompok kontrol positif diberikan antibiotik Vankomisin dan kelompok kontrol negatif diberikan Carboxyl Methyl Cellulose (CMC) 1%. Data dianalisis menggunakan Analysis of Variance (ANOVA) dan dilanjutkan dengan Uji Duncan. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa ekstrak daun asam jawa dengan konsentrasi 25%, 50%, 75%, dan 100% masing-masing mampu membentuk zona hambat pertumbuhan S.aureus sebesar 13,16 mm, 15 mm, 16mm, dan 17,50 mm. Sementara itu rata-rata diameter zona hambat yang dihasilkan oleh kelompok kontrol negatif dan positif masing-masing adalah 0 mm dan 20,50 mm. Hasil analisis data diperoleh bahwa ekstrak daun asam jawa konsentrasi 25%, 50%, 75% dan 100% menunjukkan perbedaan yang nyata dalam menghambat S. aureus dibandingkan dengan kontrol negatif dan positif pada taraf 5%. Semakin tinggi konsentrasi ekstrak maka semakin besar zona hambat yang terbentuk. Konsentrasi 25% dan 50% dapat menghambat pertumbuhan S.aureus dalam kategori lemah sedangkan konsentrasi 75% dan 100% dapat menghambat dalam kategori sedang. Oleh karena itu, konsentrasi 75% merupakan konsentrasi ekstrak daun asam jawa yang paling efektif dalam menghambat pertumbuhan S. aureus. Kata kunci: Tamarindus Indica Linn, Staphylococcus aureus, Daya hambat