Adanya insiden kelahiran kembar secara alami dari Rumpun Sapi Aceh, Bali, Peranakan Ongole (PO) dan Friesien holland (FH) mengindikasikan adanya gen pembawa sifat lahir kembar yang tersegregasi secara acak. SNP 5507_461 merupakan penanda genetik dari region BTA5 yang berasosiasi terhadap sifat lahir kembar pada rumpun sapi. Metode yang paling efektif dan mudah dalam mendeteksi keberadaan gen ini adalah validasi secara PCR. Penelitian ini bertujuan untuk mengonfirmasi adanya gen pembawa sifat lahir kembar menggunakan SNP 55057_461 dari hasil ekstraksi DNA leukosit Sapi Aceh, Bali, PO (kontrol) dan FH sebagai bagian pengembangan data Marker-Asosiated Selection (MAS). Sampel darah berasal dari lembaga pemerintah dan peternakan rakyat di beberapa wilayah Indonesia yang diekstraksi menggunakan metode garam pekat (High Salt Methode) terdiri dari tahapan isolasi leukosit, protein removal dan koleksi DNA. DNA diamplifikasi dengan dengan suhu 56o C dan dielektroforesis menggunakan 1% gel agarose. Hasil elektroforegram menunjukan bahwa SNP 5507_461 telah berhasil dikonfirmasi pada sapi PO keturunan kembar dan tiga rumpun sapi lainnya dengan ukuran pita DNA sebesar 700 bp.