Tanaman tebu (Saccharum officinarum L.) merupakan salah satu jenis tanaman tropis yang banyak tumbuh di Indonesia. Limbah yang dihasilkan pada industri gula mencapai hingga ±84%, termasuk limbah padat (ampas tebu). Ampas tebu dapat dimanfaatkan sebagai bahan baku pembuatan nanokristal selulosa (NKS). Tujuan kajian ini adalah untuk mengkaji yield dan karakteristik NKS ampas tebu, meliputi morfologi dan indeks kristalinitas yang diisolasi dari metode hidrolisis asam, oksidasi TEMPO (2,2,6,6-Tetramethylpiperidin-1-Oxy), dan metode mekanik ultrasonikasi dan homogenisasi tekanan tinggi. Serta mengkaji karakteristik barrier atau sifat permeabilitas pada film yang menggunakan NKS sebagai penguat, meliputi Water Vapor Permeability (WVP) dan Oxygen Permeability (OP). Yield tertinggi yang dihasilkan dari metode hidrolisis asam menggunakan konsentrasi asam sulfat 33% dengan waktu hidrolisis 30 menit sebesar 58%. Rata-rata dimensi partikel NKS yang diperoleh dengan metode hidrolisis asam, oksidasi TEMPO, dan metode mekanik berturut-turut adalah 4-20 nm, 15 nm, dan 3,5-60 nm. Derajat kristalinitas tertinggi yang diperoleh dari metode hidrolisis asam yaitu 89% dengan konsentrasi asam sulfat 65%, sedangkan dengan metode mekanik yaitu 71,2% menggunakan ultrasonikasi. Pada karakteristik WVP film nanokomposit diperoleh perlakuan terbaik dari metode hidrolisis asam 64% pada matriks film PVA/CMC-NKS, sedangkan OP yang didapat dengan kombinasi NKS dan matriks film NKS/nisin hybrid, didapat nilai OP terendah tanpa penggunaan nisin, yaitu 0,16 × 10-7 g/m3.h.Pa