Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui metode terbaik diantara swim up, gradien albumin dan kolom bovine serum albumin (BSA) untuk mempertahankan kualitas spermatozoa sapi aceh hasil sexing. Data dianalisis variansi dengan rancangan acak lengkap (RAL) pola searah dan dilanjutkan dengan uji berganda Duncan, dengan 4 perlakuan dan 6 ulangan. Perlakuan terdiri dari unsexing (P0, control), sexing metode swim up (P1), gradien albumin (P2) and kolom BSA (P3). Parameter kualitas yaitu motilitas sperma, viabilitas, membran plasma utuh serta abnormalitas. Viabilitas dan abnormalitas dihitung menggunakan pewarnaan eosin, serta untuk pengamatan membran plasma utuh (MPU) menggunakan larutan Hypo-Osmotic Swelling (HOS) Test. Hasil menunjukkan persentase motilitas spermatozoa X-Y terbesar dimiliki oleh P1 (X: 5,33%, Y: 89,50%), diikuti P3 (X: 81,33%, Y: 83,12%) dan P2 (X: 69,67%, Y: 75,67%). Persentase viabilitas spermatozoa X-Y terbesar dimiliki oleh P1 (X: 90,91%, Y: 90,67%), diikuti oleh P3 (X: 88,41%, Y: 89,08%) dan P2 (X: 83,16%, Y: 81,25%). Persentase MPU spermatozoa X-Y terbesar dimiliki oleh P1 (X: 88,83%, Y: 87,91%), diikuti P3 (X: 84,75%, Y: 86,50%) dan P2 (X: 82,08%, Y: 85,08%). Persentase abnomalitas spermatozoa X-Y terkecil dimiliki oleh P3 (X: 3,08%, Y: 2,75%), diikuti P2 (X: 4,25%, Y: 4,08%) dan P1 (X: 5,41%, Y: 5,33%). Hasil menunjukkan bahwa spermatozoa X-Y setelah sexing dengan ketiga metode layak untuk pelaksanaa inseminasi buatan atau diproses menjadi sperma beku. Berdasarkan hasil penelitian, sexing berpengaruh nyata (P