Umbi gadung merupakan sumber inulin yang potensial.Penelitian ini bertujuan untuk menentukan kadar inulin pada umbi gadung serta karakterisasi sifat fisiko-kimia dan aktivitas inulin sebagai prebiotik. Ekstraksi inulin dari umbi gadung telah dilakukan dengan metode perendaman dan pemanasan pada suhu 90˚C.Rendemen inulin umbi gadung diperoleh sebesar 0,725%. Analisis HPLC dilakukan untuk menentukan konsentrasi inulin dari umbi gadung dan didapatkan konsentrasi inulin sebesar 666,46 ppm. Karakteristik fisiko-kimia ditentukan terhadap kelarutan, kadar air, viskositas dan daya serap air. Hasil penelitian menunjukkan bahwa inulin dari umbi gadung memiliki kelarutan dan daya serap air berturut-turut sebesar 93,6% dan 9,81%. Analisis prebiotik inulin menunjukkan bahwa ekstrak inulin umbi gadung dapat meningkatkan pertumbuhan bakteri L. acidopilus dan E. coli, dengan aktivitas prebiotik sebesar 0,345. Kata Kunci:Inulin, gadung (Dioscorea alata), prebiotik.