ABSTRAK Penelitian ini bertujuan menguji validitas kit ELISA 5β-hydroxy- etiocholanolone (5β-hydroxy-CM) untuk mengukur konsentrasi metabolit hormon kortisol pada feses kerbau toraya menggunakan validasi analitik dan biologis. Validasi analitik yang dilakukan adalah parallelism, akurasi, presisi, dan sensitifitas, sedangkan validasi biologis dilakukan dengan membandingkan konsentrasi metabolit kortisol pada feses kerbau toraya sebelum pertandingan (adu kerbau/pa’silaga tedong) pada saat upacara rambu solo dan setelah 7 hari pertandingan pa’silaga tedong, dan membandingkan konsentrasi metabolit kortisol pada kerbau petarung dan kerbau non petarung. Pengukuran metabolit kortisol pada feses kerbau toraya menggunakan metode ELISA. Hasil uji parallelism menunjukkan kurva sampel sejajar dengan kurva standar 5β-hydroxy-CM. Akurasi dan sensitifitas assay 5β-hydroxy-CM adalah 96,21%±7,59, dan 0,77pg/g, sedangkan presisi berdasarkan nilai koefisien variasi (CV) intra-assay dan inter- assay masing-masing