ABSTRAK Salah satu parameter yang harus dievaluasi sebelum dilakukan analisis hormon kortisol adalah waktu koleksi sampel. Hal ini karena terdapat variasi diurnal konsentrasi metabolit kortisol pada pagi, siang, dan malam hari. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh waktu koleksi sampel secara non-invasif terhadap konsentrasi metabolit kortisol beberapa spesies hewan diurnal, krepuskular, dan nokturnal. Sampel yang digunakan sebanyak 120 sampel dengan 48 sampel untuk hewan diurnal (kambing kacang, kambing PE, kerbau, dan kuda), 36 sampel untuk hewan krepuskular (kelinci dan hamster), dan 36 sampel untuk hewan nokturnal (tikus dan mencit). Sampel feses hewan diurnal dikoleksi pada pagi dan siang hari, sedangkan pada hewan krepuskular dan nokturnal dikoleksi pada pagi, siang, dan malam hari. Sampel feses diekstraksi terlebih dahulu dan selanjutnya dilakukan pengukuran konsentrasi metabolit kortisol menggunakan teknik enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Data yang diperoleh diuji menggunakan uji t-berpasangan untuk hewan diurnal dan uji one way ANOVA untuk hewan krepuskular dan nokturnal. Hasil menunjukkan konsentrasi metabolit kortisol di dalam feses hewan diurnal pada pagi dan siang hari tidak berbeda (P>0,05). Hasil yang sama juga terlihat pada hewan krepuskular, konsentrasi metabolit kortisol pada pagi, siang, dan malam hari tidak berbeda (P>0,05). Untuk hewan nokturnal yaitu mencit konsentrasi metabolit kortisol pada pagi, siang, dan malam hari tidak berbeda (P>0,05), tetapi pada tikus, konsentrasi metabolit kortisol pada malam hari lebih tinggi secara signifikan dibandingkan pada pagi dan siang hari (P