ABSTRAK Waktu inkubasi merupakan salah satu faktor penting pada proses pengukuran hormon menggunakan metode enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh perbedaan waktu inkubasi pada proses pengikatan antara antibodi (5β-hydroxy-CM) dengan antigen (hormon kortisol di dalam sampel feses) terhadap konsentrasi metabolit kortisol pada sampel feses gajah sumatera dan kambing Peranakan Etawah (PE). Sampel feses gajah dikoleksi dari Pusat Konservasi Gajah Saree, sedangkan sampel feses kambing PE dikoleksi dari peternakan Adoe A. Penelitian terdiri dari dua kelompok perlakuan dengan 6 ulangan setiap perlakuan. Perlakuan 1 (P1) yaitu inkubasi selama 2 jam dan perlakuan 2 (P2) yaitu inkubasi selama 18 jam (overnight). Pengukuran hormon dilakukan menggunakan metode ELISA. Data dianalisis menggunakan uji T berpasangan (paired sample t-tes). Hasil penelitian menunjukan rataan (±SD) konsentrasi metabolit kortisol pada P1 dan P2 dari sampel feses gajah sumatera secara berturut-turut adalah 100,51 ± 16,95 ng/g feses dan 118,92 ± 11,86 ng/g feses, sedangkan dari sampel feses kambing PE, rataan (±SD) konsentrasi metabolit kortisol pada P1 dan P2 masing-masing sebesar 246,77 ± 43,98 ng/g feses dan 283,29 ± 46,40 ng/g feses. Hasil analisis statistik menunjukkan konsentrasi metabolit kortisol pada P2 lebih tinggi secara signifikan (P