ABSTRAK Vibrio alginolyticus merupakan bakteri yang dapat menyebabkan penyakit vibriosis dan meningkatkan resistensi terhadap antibiotik, imunitas dan desinfektan. Pembentukan biofilm oleh Vibrio alginolyticus menyebabkan masalah yang serius dalam bidang kesehatan. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui efek ekstrak daun waru (Hibiscus tiliaceus) sebagai penghambat pembentukan biofilm yang disebabkan oleh bakteri Vibrio alginolyticus secara in vitro. Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah Microtitter Plate Biofilm Assay. Perlakuan yang diberikan berupa kontrol positif, kontrol negatif dan penambahan ekstrak etanol daun waru dengan konsentrasi 2, 4, 8 dan 10%. Pengukuran pembentukan biofilm dilakukan dengan menggunakan Microplate Reader dengan waktu inkubasi selama 60 jam pada suhu 25-30˚C, dan diperoleh data kuantitatif berupa nilai absorbansi (OD570mn). Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa ekstrak daun waru (Hibiscus tiliaceus) yang mengandung zat aktif flavonoid, steroid, tanin dan flavonoid menunjukkan aktivitas mampu menghambat pembentukan biofilm. Konsentrasi 10% memiliki potensi penghambatan biofilm tertinggi dengan rata-rata persentase hambatan sebesar 75,10%. Kata kunci : Vibriosis, antibiofilm, Hibiscus tiliaceus, nilai absorbansi ABSTRACT Vibrio alginolyticus are bacteria that cause vibriosis and increasing antibiotic resistance, immunity and disinfectants. The biofilm formation of this bacteria will cause serious problems in health.The purpose of this study was to find out the effects of waru leaves extract (Hibiscus tiliaceus) as an inhibitor of biofilm formation of Vibrio alginolyticus in vitro. The method used in this study was a microtiter plate biofilm assay. The treatment was done by using positive control, negative control and the addition of ethanol extract of waru leaves with different concentrations of 2, 4, 8 and 10%. The measurement of biofilm formation was done by using Microplate Reader at an incubation time of 60 hours in 25-30˚C temperature, and quantitative data were obtained as absorbance values (OD570mn). The results of this study showed that waru leaves extract (Hibiscus tiliaceus) containing active flavonoids, steroids, tannins and flavonoids showed activity capable of inhibiting biofilm formation. Concentration of 10% had the highest potential for biofilm inhibition 75.10%. Keywords: Vibriosis, antibiofilm, Hibiscus tiliaceus, Optical Density