ABSTRAK Munculnya masalah resistensi obat pada penyakit tuberkulosis yang dikenal dengan multidrug-resistant tuberculosis (MDR-TB) merupakan tantangan baru dalam pengobatan dan pemberantasan tuberkulosis di dunia. MDR-TB muncul akibat adanya mutasi spontan pada kromosom Mycobacterium tuberculosis sehingga menyebabkan resistensi terhadap rifampisin dan isoniazid dengan atau tanpa resistensi obat anti tuberkulosis (OAT) lainnya. Polymerase chain reaction (PCR) yang dilanjutkan dengan sekuensing DNA dapat digunakan untuk mendeteksi mutasi pada gen yang menyebabkan resistensi. PCR memerlukan optimasi dalam setiap penggunaannya agar dapat memperoleh hasil yang optimal. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan kondisi optimal PCR untuk mengamplifikasi gen pengkode resistensi obat anti tuberkulosis yaitu gen rpoB, katG, embB, rpsL dan pncA. Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratoris secara in vitro. Sampel yang digunakan berupa DNA dari sputum penderita MDR-TB di Poli DOTS RSUD dr. Zainoel Abidin Banda Aceh. Diagnosis MDR-TB ditegakkan melalui pemeriksaan basil tahan asam, kultur, uji sensitivitas dan isolasi DNA di Laboratorium Tuberkulosis, Departemen Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. Tujuh sampel yang digunakan terdiri dari 2 seri: seri 1 merupakan sampel DNA yang diisolasi pada tahun 2012 dan seri 2 merupakan sampel DNA yang diisolasi pada tahun 2013. Kondisi optimal untuk amplifikasi kelima gen pengkode resistensi OAT lini pertama di dalam 20 µl volume reaksi adalah 1,5 µl MgCl2 konsentrasi 1,875 mM, 6 µl templat DNA dari sampel seri 1 dan 2 µl templat DNA dari sampel seri 2 dengan 30 siklus reaksi. Suhu annealing yang optimal untuk gen rpoB adalah 57oC, gen pncA 60oC dan gen katG, embB serta rpsL 59oC. Kata kunci : MDR-TB, Optimasi, PCR