Staphylococcus aureus merupakan salah satu bakteri yang terdapat pada preputium, dapat menyebabkan kontaminasi semen dan penularan ke organ reproduksi betina sehingga terjadi subfertil dan infertilitas baik secara kawin alam maupun inseminasi buatan. Faktor virulensi Staphylococcus aureus terutama pada proses adhesi sangat dipengaruhi oleh sifat hidrofobisitas dan biofilm bakteri tersebut. Hidrofobisitas dan biofilm merupakan parameter untuk menentukan jalur patogenisitas suatu bakteri. Interaksi hidrofobik dari komponen permukaan sel bakteri dengan sel inang akan memicu kolonisasi bakteri dan pembentukan biofilm. Antibiotik dapat melemahkan aktivitas virulensi bakteri dengan meningkatkan sifat hidrofobisitas dan menghambat pembentukan biofilm, namun penggunaan antibiotik yang tidak tepat dan terus menerus akan menyebabkan resistensi terhadap antibiotik. Penelitian ini bertujuan untuk melihat karaksteristik dan aktivitas antibiotik terhadap hidrofobisitas dan biofilm Stapylococcus aureus isolat preputium sapi Aceh. Penelitian bersifat eksploratif dan eksperimental, menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) pola faktorial dengan menggunakan tiga jenis antibiotik, tiga konsentrasi dan tiga kali ulangan. Antibiotik yang digunakan adalah tetrasiklin, oksitetrasiklin dan fosfomisin dengan konsentrasi masing-masing 10%, 20% dan 30% (mg/mL). Pengujian hidrofobisitas dan biofilm dilakukan pada media Nutrient Broth (NB), menggunakan mikroplat U-bottom polystyrene 96 wells. Penentuan hidrofobisitas bakteri dilakukan dengan modifikasi BATH pada hidrokarbon xylol, sedangkan pewarnaan biofilm menggunakan kristal violet 1%. Optical Density (OD) hidrofobisitas dibaca pada λ 600 nm dan biofilm dibaca pada λ 595 nm. Data hasil penelitian dianalisis dengan menggunakan Analysis Of Variance (ANOVA). Hasil penelitian menunjukkan aktivitas virulensi Staphylococcus aureus isolat preputium sapi Aceh berdasarkan karaksteristik hidrofobisitas dan biofilm tergolong positif moderat, yaitu 36,76% dan 2,667cell/µL. Uji hidrofobisitas menunjukkan jenis antibiotik berpengaruh secara nyata (P