Penelitian ini bertujuan untuk menguji validitas dua jenis kit kortisol ELISA komersial, yaitu EIA-1887 dan EIA-K003-H5 dalam mengukur konsentrasi kortisol pada sampel feses sapi aceh. Sampel feses dikoleksi dari tiga ekor sapi aceh betina dewasa saat sebelum diberi cekaman (pre-stress) dan setelah diberi cekaman (post-stress) masing-masing tiga sampel. Sampel feses kemudian dikeringkan dan diekstrak menggunakan 3 ml metanol 80%, dan dilakukan uji validasi menggunakan kit EIA-1887 dan EIA-K003-H5. Uji validasi yang dilakukan terdiri atas validasi analitik (pararellism, akurasi, dan presisi) dan validasi biologis. Konsentrasi metabolit kortisol diukur menggunakan teknik enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Data hasil uji parallelism dianalisis menggunakan uji persamaan kemiringan, presisi dihitung % CV intra-assay dan inter-assay, akurasi dihitung % recovery, dan data hasil validasi biologis dianalisis menggunakan uji T. Hasil uji pararellism menunjukkan kurva sampel dari ekstrak feses yang diencerkan secara berulang tidak paralel dengan kurva standar untuk kit EIA-1887, sedangkan pada kit EIA-K003-H5 kurva sampel paralel dengan kurva standar. Akurasi kit EIA-1887 dan kit EIA-K003-H5 masing- masing adalah 103,43±7,85% dan 99,76±3,77%. Presisi (% CV intra- dan inter-assay) pada kedua kit tersebut adalah kurang dari10%. Hasil uji validasi biologis menggunakan kit EIA-1887 menunjukkan konsentrasi metabolit kortisol yang terukur antara kondisi pre-stress dan post-stress tidak berbeda secara signifikan (P>0,05), sedangkan pada kit EIA-K003-H5, konsentrasi metabolit kortisol yang terukur pada post-stress secara signifikan lebih tinggi dibandingkan pre-stress (P