Produksi enzim lipase dari mikroorganisme dipengaruhi oleh kondisi optimum fermentasi, seperti waktu, suhu dan pH. Penelitian ini dilakukan dengan memvariasikan waktu (0-48 jam), suhu (50, 60 dan 70 oC) dan pH (8,5 ; 9,0 ; 9,5 ; 10,0 dan 10,5) fermentasi Bacillus sp. isolat Sabang dalam memproduksi lipase. Uji kualitatif membuktikan bahwa isolat Sabang mampu menghasilkan lipase yang diindikasikan dari pendar jingga yang diperoleh setelah disinari dengan UV ketika ditumbuhkan dalam media Production Broth yang mengandung rhodamin b. Trend aktivitas lipase yang dihasilkan pada penentuan waktu optimum memiliki dua puncak, yaitu pada 16 jam sebesar 5,27 U/mL dan 46 jam sebesar 5,01 U/mL. Aktivitas lipase tertinggi untuk suhu 50, 60 dan 70oC berturut-turut adalah 5,99 U/mL, 6,63 U/mL dan 6,88 U/mL. Aktivitas pada pH 8,5 ; 9,0 ; 9,5 ; 10,0 dan 10,5 pada waktu dan suhu fermentasi optimum secara berurutan adalah 5,84 U/mL, 6,88 U/mL, 5,83 U/mL, 5,36 U/mL dan 5,27 U/mL. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa produksi lipase dari isolat Sabang didapatkan ketika fermentasi dilakukan selama 15 jam, pada suhu 70oC dan pH 9,0 dengan aktivitas sebesar 6,88 U/mL.