ABSTRAK Lipase (triasil gliserol hidrolase EC 3.1.1.3) merupakan enzim yang mengkatalisasi reaksi hidrolisis trigliserida menjadi gliserol dan asam lemak bebas. Penelitian ini bertujuan mendapatkan lipase termostabil dari bakteri Bacillus sp. isolat Jaboi Sabang menggunakan pelarut aseton dengan tingkat kemurnian lebih tinggi dibanding ekstrak kasar enzim dan mengkarakterisasi enzim yang dihasilkan meliputi suhu, konsentrasi substrat dan berat molekul enzim. Aktivitas spesifik lipase tertinggi diperoleh pada fraksi II dengan persen kejenuhan aseton 20-40% sebesar 61,005 Unit/mg protein. Fraksi II memiliki tingkat kemurnian 2,397 kali dibanding ekstrak kasar enzim. Karakterisasi lipase Bacillus sp. isolat Jaboi Sabang menunjukkan bahwa enzim mempunyai suhu optimum 60°C dengan aktivitas spesifik sebesar 30,615 Unit/mg. Lipase bekerja baik pada substrat p-nitrofenil palmitat dengan konsentrasi substrat optimum sebesar 10 mM. Elektroforegram SDS-PAGE dan zimografi diperoleh adanya pita protein yang memiliki aktivitas lipase dengan berat molekul 154 kDa. Lipase Bacillus sp. isolat lokal Jaboi Sabang yang didapat merupakan satu jenis lipase yang bersifat termostabil, bekerja pada substrat rantai panjang (p-nitrofenil palmitat) dan memiliki berat molekul besar. Lipase yang dihasilkan diduga merupakan lipase khas isolat lokal Jaboi Sabang. Kata kunci: lipase termostabil, isolat Jaboi Sabang, fraksinasi aseton