Bakteri proteolitik di rumen sapi mempunyai kemampuan untuk memecah protein pada pakan dengan menghasilkan enzim protease. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui jenis bakteri penghasil enzim protease pada rumen sapi aceh yang dilakukan berdasarkan analisis gen 16S rRNA melalui PCR-sekuensing. Sampel cairan rumen sapi aceh diambil dari RPH Lambaro Aceh Besar, lalu ditanam ke media selektif Skim Milk Agar dan diinkubasi anaerob pada suhu 39 0C selama 48 jam. Koloni bakteri proteolitik yang tumbuh dan memiliki zona bening terluas diambil untuk dilakukan isolasi DNA total dan amplifikasi gen 16s rRNA. Hasil amplifikasi gen ini kemudian disekuensing, selanjutnya hasil sekuensing di analisis di NCBI untuk melihat homologi bakteri sampel dengan yang dideposit di GenBank. Hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa spesies isolat bakteri penghasil enzim protease memiliki kedekatan dengan bakteri Kosakonia arachidis strain Ah-143 sebesar 96% sesuai dengan urutan DNA dan ukuran posisi yang sama dengan gen yang ada di GenBank.