Susu merupakan bahan pangan yang memiliki nilai gizi tinggi. Nilai gizi tinggi pada susu menjadi media yang disukai oleh mikroorganisme untuk pertumbuhan dan perkembangannya. Penanganan susu salah satunya adalah pengolahan dan pengawetan berupa fermentasi susu menjadi kefir. Penelitian ini sebelumnya menginformasikan bahwa kefir merupakan salah satu produk susu fermentasi yang memiliki rasa spesifik hasil dari fermentasi bakteri asam laktat dan khamir dengan penambahan madu sebagai bahan bernustrisi bergizi tinggi karena madu mengandung protein, vitamin, mineral, asam organik yang mengandung senyawa antimikrobia yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri enterotoksin. Dalam penelitian ini akan diuji Total Plate Count, uji hambat dan sineresis terhadap kefir dengan penambahan madu dalam menghambat bakteri enterotoksin. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui daya hambat kefir dengan penambahan madu terhadap bakteri enterotoksin. Penelitian ini dilakukan dengan menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) pola faktorial dengan 3 kali ulangan. Faktor A merupakan persentase starter kefir terdiri dari dua taraf (a1) 2,5 persen dan (a2) 5 persen. Faktor B (madu) merupakan persentase penambahan madu terdiri dari tiga taraf (b1) 0 persen, (b2) 4 persen, dan (b3) 8 persen. Penelitian pendahuluan berupa pengamatan terhadap populasi bakteri asam laktat (BAL) dan khamir pada grain kefir yang digunakan dengan menggunakan media selektif masing-masing berupa deMan Rogosa Sharpe Agar (MRSA) dan Potatoe Dextrose Agar (PDA). Pengamatan utama dilakukan terhadap uji total mikroba dihitung dengan menggunakan metode hitungan cawan, uji hambat dengan menggunakan metode difusi sumur dan sineresis menggunakan metode Harwalkar dan Kalab. Hasil pengamatan pada uji pendahuluan diperoleh nilai masing-masing dari populasi BAL dan khamir grain kefir sebesar 1,48 x108 CFU/ml dan 7,7 x105 CFU/ml. Nilai ini telah sesuai dengan standar CODEX 234 tahun 2003 dimana populasi BAL dan khamir sebesar 107 CFU/ml dan 104 CFU/ml. Hasil pengamatan dari penelitian utama memperlihatkan pengaruh penambahan madu dan konsentrasi starter dari total mikroba tertinggi berbeda sangat nyata pada penambahan madu sebesar 8% dengan konsentrasi starter kefir 5 persen sebesar 8.37 log CFU/ml-1. Nilai sineresis terbaik diperoleh pada penambahan madu 8 persen dengan konsentrasi starter 5 persen. Secara statistik nilai uji hambat terhadap bakteri enterotoksin tidak memperlihatkan pengaruh yang nyata, nilai tertinggi diperoleh pada penambahan madu sebesar 8 persen dan konsentrasi starter 5 persen dengan nilai rerata 6.2 mm. Disimpulkan pada penggunaan persentase starter 5 persen dan 8 persen madu produk kefir mempunyai kemampuan dalam menghambat pertumbuhan bakteri enterotoksin terbaik dibandingkan perlakuan lainnya