Β-karoten merupakan suatu kelompok senyawa antioksidan yang memiliki peran mengikat radikal bebas yang terbentuk akibat proses dari metabolisme spermatozoa pada saat pengenceran dan pembekuan berlangsung. Radikal bebas yang dihasilkan berupa suatu senyawa yang disebut dengan reactive oxygen species (ROS) yang dapat mengoksidasi lipid pada membran plasma sel spermatozoa. Tujuan penelitian ini adalah mengetahui konsentrasi β-karoten yang tepat ke dalam pengencer larutan Ringer kuning telur terhadap kualitas spermatozoa ikan seurukan (Osteochilus vittatus) pada proses pembekuan. Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) satu arah dengan 5 perlakuan (kontrol (P0); β-karoten : 0,002 g (P1), 0,004 g (P2), 0,006 g (P3), 0,008 g (P4)) dan 4 ulangan. Kualitas spermatozoa dievaluasi sebanyak 3 kali, yakni pengenceran, ekuilibrasi, dan pasca thawing 48, 96, dan 144 jam. Data yang diperoleh dianalisa dengan ANOVA menggunakan SPSS. Perbedaaan antar perlakuan diuji lanjut dengan uji beda nyata terkecil (BNT). Hasil penelitian menunjukkan bahwa penambahan β-karoten ke dalam bahan pengencer semen memberikan pengaruh tidak nyata dibandingkan kontrol (P>0,05). Persentase motilitas tertinggi pada P1 setelah 48, 96 dan 144 jam penyimpanan berturut-turut adalah 59,3%; 41,1%; 19,7%. Sedangkam persentase spermatozoa hidup dan MPU pada penambahan β-karoten tidak berbeda nyata dengan kontrol. Spermatozoa setelah pembekuan 48 dan 96 jam masih dapat digunakan untuk inseminasi buatan karena diatas 40%. Kata kunci: Ikan seurukan (Osteochilus vittatus), pembekuan spermatozao, ROS, peroksidasi lipid, antioksidan, β-karoten.