Kualitas spermatozoa kerbau lokal (Bubalus bubalis) pada berbagai frekuensi ejakulasi sangat perlu dilakukan untuk pelestarian plasma nutfah kerbau lokal. Penelitian ini dilakukan untuk mengamati kualitas spermatozoa kerbau lokal (Bubalus bubalis) pada berbagai frekuensi ejakulasi dengan menggunakan 2 ekor pejantan dengan selang waktu perlakuan selama 1 jam. Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Riset, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Syiah Kuala, Darusalam, Banda Aceh. Data yang diperoleh dianalisis dengan analysis of variance (ANAVA) pola satu arah yang dilanjutkan dengan uji berganda Duncan. Hasil penelitian kualitas spermatozoa kerbau lokal pada ejakulasi pertama, kedua dan ketiga secara berturut-turut, volume adalah 1,76 ± 0,61 ml, 1,10 ± 0,27 ml dan 0,73 ± 0,39 ml. pH semen adalah 7 pada berbagai frekuensi ejakulat. Konsentrasi spermatozoa adalah 1,30±0,07×109/ml, 1,02±0,08×109/ml dan 0,74±0,09×109/ml. Persentase motilitas adalah 64,34±7,76%, 58,78±11,22% dan 48,19±5,30%. Persentase spermatozoa hidup adalah 56,23±7,39%, 62,84±11,48% dan 48,59±8,54%. Persentase spermatozoa abnormal sebesar 20,24±1,90%, 21,20±9,38% dan 22,32±2,51%. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa frekuensi ejakulasi berpengaruh nyata (P