ABSTRAK Jruek drien merupakan makanan tradisional Aceh, hasil dari fermentasi arilus durian yang melibatkan mikroorganisme Bakteri Asam Laktat (BAL). Berdasarkan penelitian sebelumnya, Lactobacillus (JD-1 dan JD-4) adalah BAL yang diperoleh dari jruek drien melalui identifikasi fenotipik. Lactobacillus dikenal memiliki potensi sebagai probiotik. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi dan menganalisis hubungan filogenetik isolat Lactobacillus tersebut melalui analisis gen 16S rRNA. Pertama, isolat disubkultur pada media deMann Rogosa Sharpe Agar (MRSA) dan Tryptone Soy Broth (TSB). Selanjutnya, DNA diisolasi dengan menggunakan QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen). Lalu kuantitas dan kualitas DNA isolat dihitung menggunakan nanofotometer dan elektroforesis. Kemudian isolat DNA diamplifikasi menggunakan primer Bact 27F dan Uni 1492R. Setelah itu, pohon filogenetik dari sekuensing DNA dikonstruksi dengan algoritma neighbor joining dan bootstrap 1000 kali. Hasil penelitian menunjukkan bahwa hasil sekuensing gen 16S rRNA adalah 1424 bp (JD-1) dan 1422 bp (JD-4). Isolat JD-1 secara genotipik diidentifikasi sebagai Bacillus subtilis dengan nilai bootstrap sebesar 79% dan query cover 99%. Isolat JD-4 diidentifikasi sebagai genus Bacillus dengan nilai bootstrap sebesar 93%. 4. JD-1 dan JD-4 memiliki potensi sebagai probiotik. Kata kunci: Jruek drien, Lactobacillus, gen 16S rRNA, pohon filogenetik ABSTRACT Jruek drien is Acehnese traditional food from aril durian fermented by Lactic Acid Bacteria (LAB). Based on previous research, Lactobacillus (JD-1 and the JD-4) were LAB from Jruek drien by phenotypic identification. Lactobacillus well known as potential probiotics. The aim of this research is to identify and analyze the phylogenetic relationship of Lactobacillus isolates based on analysis of 16S rRNA gene. Firstly, the isolate cultured in deMann Rogosa Sharpe Agar (MRSA) and Tryptone Soy Broth (TSB) medium. Then, DNA isolation is using by QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen). After that, the DNA is measured by nanophotometer and electrophoresis. Furthermore, the phylogenetic tree from DNA sequences constructed by neighbor joining algorithm and bootstrap 1000 times. The results showed that sequencing of 16S rRNA gene are 1424 bp (JD-1) and 1422 bp (JD-4). The JD-1 isolates were genotipically identified as Bacillus subtilis by the bootstrap 79% and query cover 99%. JD-4 isolates were identified as the genus Bacillus with a bootstrap 93%. JD-1 and JD-4 has potential as probiotic. Keywords: Jruek drien, Lactobacillus, 16S rRNA gene, phylogenetic tree