Penelitian ini bertujuan mengetahui pengaruh pemberian PGF2α terhadap peningkatan kualitas semen sapi bali. Materi penelitian yang digunakan adalah sapi bali sebanyak 3 ekor yang berumur 2; 3,5 dan 5 tahun. Sampel yang digunakan pada penelitian ini berupa semen dari sapi bali. Penelitian ini menggunakan Rancangan Bujursangkar Latin dengan 3 perlakuan dan 3 periode waktu perlakuan. Perlakuan yang diterapkan adalah P1 (5 ml NaCl fisiologis), P2 (25 mg prostaglandin), dan P3 (37,5 mg prostaglandin), sedangkan periode waktu adalah 3 minggu kegiatan perlakuan yakni minggu ke-1, 2, dan 3. Berdasarkan hasil uji statistik menunjukan bahwa pemberian PGF2α dengan dosis 25 mg dan PGF2α dosis 37,5 mg tidak berpengaruh (P>0,05) terhadap pemeriksaan volume, warna, pH, konsistensi, konsentrasi dan motilitas spermatozoa sapi bali. Volume semen yang diperoleh yaitu P1, P2 dan P3 masing-masing adalah 6,5±0,9 ml; 6,3±0,6 ml; dan 6,2±1,2 ml. Warna semen antara P1, P2, dan P3 adalah krem dan putih susu. Derajat keasaman (pH) pada penelitian ini antara P1, P2 dan P3 adalah 6,7±0,6; 7,1±0,2; dan 6,5±0,2. Konsentrasi spermatozoa pada P1, P2, dan P3 masing-masing adalah 1.328±96,43 (106); 1.354±102,19 (106); dan 1.353,3±88,55 (106). Motilitas spermatozoa pada P1, P2, dan P3 masing-masing adalah 73,3± 2,8(%); 71,6 ± 2,8(%); dan 73,3 ± 2,8(%). Dari hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa pemberian PGF2α tidak memengaruhi spermatozoa namun hasil yang didapatkan masih dalam kisaran normal.