β-karoten dan glutation merupakan suatu kelompok senyawa antioksidan yang memiliki peran dalam menangkap radikal bebas yang terbentuk akibat proses dari metabolisme spermatozoa pada saat pengenceran dan pembekuan berlangsung. Radikal bebas yang dihasilkan berupa suatu senyawa yang disebut dengan reactive oxygen species (ROS) yang dapat mengoksidasi lipid pada membran plasma sel spermatozoa. Tujuan penelitian ini adalah mengetahui perbandingan antioksidan β-karoten dan glutation dengan berbagai konsentrasi yang ditambahkan ke dalam pengencer tris kuning telur terhadap kualitas semen beku kerbau lumpur. Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) satu arah dengan 7 perlakuan (kontrol (P0); β-karoten : 0,00625 g (P1), 0,0125 (P2) g, 0,025g (P3); glutation: 0,05 g (P4), 0,10 g (P5), 0,15 g (P6)) dan 3 ulangan. Semen segar kerbau (Bubalus bubalis) diencerkan menggunakan modifikasi bahan pengencer tris kuning telur dengan penambahan antioksidan sesuai perlakuan dan diekulibrasi selama 4 jam. Kualitas spermatozoa dievaluasi sebanyak 3 kali, yakni pengenceran, ekuilibrasi, dan pasca thawing (pencairan kembali). Data yang diperoleh dari hasil penelitian ini dianalisa dengan ANAVA menggunakan SPSS. Perbedaan antar perlakuan diuji lanjut dengan uji beda nyata terkecil (BNT). Hasil penelitian menunjukkan bahwa penambahan β-karoten dan glutation ke dalam bahan pengencer semen memberikan pengaruh yang nyata (p