Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi senyawa sitotoksik dari ekstrak etil asetat kulit akar biduri (Calotropis gigantea). Pengujian aktivitas sitotoksik terhadap Artemia salina menggunakan metode Brine Shrimp Lethality (BSLT). Kulit akar C. gigantea dimaserasi menggunakan pelarut metanol dan dipartisi menggunakan pelarut n-heksana dan etil asetat diperoleh ekstrak pekat masing-masing sebanyak sebanyak 145,15 ; 7,45 dan 66,15 gram. Ekstrak etil asetat difraksinasi menggunakan metode kromatografi kolom vakum menghasilkan 4 kelompok fraksi yaitu fraksi A (1 g), fraksi B (0,54 g), fraksi C (0,15 g) dan fraksi D (7 g). Fraksi D direkromatografi menggunakan kromatografi kolom gravitasi menghasilkan 40 fraksi. Fraksi D dan sub fraksi D1 diuji aktivitas sitotoksik terhadap Artemia salina. Hasil uji aktivitas sitotoksik menunjukkan bahwa fraksi D memiliki aktivitas sitotoksik lebih besar dibandingkan dengan sub fraksi D1 dengan nilai LC50 masing-masing sebesar 37,02 µg/mL dan 329,58 µg/mL. Kontrol positif digunakan obat kanker vinkristin sulfat dengan LC50 sebesar 0,209 µg/mL. Hasil uji fitokimia menunjukan bahwa sub fraksi D1 mengandung senyawa golongan steroid dan saponin. Hasil karakterisasi sub fraksi D1 menggunakan FTIR menunjukkan adanya serapan untuk gugus OH, C-H, C=O dan C-O. Struktur senyawa tersebut masih diteliti lebih lanjut dengan metode kromatografi gas- spektrometri massa. Kata Kunci: Tumbuhan Biduri (Calotropis gigantea), BSLT, Artemia salina, aktivitas sitotoksik