ABSTRAK Temulawak merupakan salah satu jenis tanaman yang tidak dapat dipisahkan dari kehidupan masyarakat Indonesia, dengan perkembangan ilmu pengetahuan dibidang kedokteran, penyakit infeksi merupakan masalah utama dalam bidang kesehatan di Indonesia. Salah satu bakteri penyebab tersebut adalah Escherichia coli. Penggunaan antibiotik yang tidak terkendali memicu peningkatan resistensi bakteri terhadap antibiotik. Tanaman tradisional diperlukan untuk memecahkan masalah tesebut. Temulawak dipercaya dapat digunakan sebagai antibakteri, tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui adanya aktivitas antibakteri ekstrak temulawak (Curcuma xantorrhiza Roxb.) terhadap Escherichia coli. Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratorium dengan pengujian secara in vitro dan dengan metode difusi agar, kemudian daya hambat diukur dengan menggunakan penggaris. Dalam penelitian ini digunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) yang menggunakan 6 kelompok perlakuan, satu kelompok kontrol positif (Kloramfenikol30 µg) dan satu kelompok kontrol negatif Carboxyl Methyl Cellulose (CMC)1%. Masing-masing kelompok dilakukan empat kali pengulangan sesuai dengan rumus perhitungan pengulangan. Data dianalisis menggunakan Analysis of Variance (ANOVA). Hasil uji daya hambat ekstrak etanol temulawak (Curcuma xanthorhiza Roxb.) pada konsentrasi 25%, 50%, 75% dan 100% terhadap zona hambat Escherichia coli diperoleh diameter rata-rata 9,5 mm, 10,25 mm, 11,125 mm dan 11,750 mm. Kelompok perlakuan (kontrol negatif) dan (kontrol positif) menghasilkan zona hambat dengan diameter 0 mm dan 23,625 mm. Semakin besar konsentrasi yang diberikan maka semakin besar diameter zona hambat yang terbentuk. Kata kunci : Escherichia coli, Curcuma xanthorrhiza, Antibakteri