ABSTRAK Henna (Lawsonia inermis L.) telah lama dikenal sebagai tumbuhan dengan banyak khasiat. Beberapa penelitian telah membuktikan bahwa daun henna memiliki aktivitas antibakteri karena memiliki kandungan metabolit sekunder berupa senyawa fenol (tannin/quinone), flavonoid, alkaloid, dan saponin. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antibakteri ekstrak etanol daun henna terhadap Acinetobacter sp. isolat klinis secara in vitro. Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan 7 perlakuan, terdiri atas kontrol negatif (akuades), kontrol positif (meropenem 10 µg), dan ekstrak etanol daun henna konsentrasi 75%, 50%, 25%, 12,5% dan 6,25%. Masing-masing perlakuan diulang sebanyak 5 kali. Uji daya hambat ekstrak etanol daun henna terhadap pertumbuhan Acinetobacter sp. dilakukan dengan metode difusi cakram. Parameter yang diamati adalah diameter zona hambat yang terbentuk. Data dianalisis dengan ANOVA dan dilanjutkan dengan uji Beda Nyata Jujur (BNJ). Ekstrak etanol daun henna konsentrasi 75%, 50%, 25%, 12,5% dan 6,25% dapat menghambat pertumbuhan Acinetobacter sp. dengan rata-rata diameter zona hambat masing-masing sebesar 15,5 mm, 14,2 mm, 12,9 mm, 11 mm dan 10 mm. Hasil analisa data menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun henna memberikan pengaruh yang sangat nyata dalam menghambat pertumbuhan Acinetobacter sp. Penelitian ini dapat disimpulkan bahwa ekstrak etanol daun henna dapat menghambat pertumbuhan Acinetobacter sp. di mana konsentrasi 50% merupakan konsentrasi yang paling efektif. Kata Kunci: Lawsonia inermis L., antibakteri , Acinetobacter sp.