ABSTRAK Indonesia merupakan negara yang kaya akan keanekaragaman hayati yang berperan sebagai tumbuhan berkhasiat obat seperti jeruk nipis (Citrus aurantifolia) yang sangat popular di dalam masyarakat dalam mengobati radang tenggorokan, ketombe, menghindari kegemukan dan bersifat sebagai antibakteri. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antibakteri minyak atsiri kulit buah jeruk nipis terhadap isolat Staphylococcus aureus secara in vitro. Jenis penelitian ini adalah eksperimental laboratorium dengan menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan 4 kali pengulangan yang terdiri dari 7 kelompok perlakuan yaitu 5 konsentrasi (30%, 40%, 50%, 60% dan 70%) dan 2 kontrol (Tween 80 sebagai kontrol negatif dan Amoksisilin 30 µg sebagai kontrol positif). Metode uji aktivitas antibakteri menggunakan difusi cakram Kirby-Bauer. Hasil penelitian menunjukkan minyak atsiri kulit buah jeruk nipis (Citrus aurantifolia) dengan konsentrasi 30%, 40%, 50%, 60% dan 70% memiliki aktivitas antibakteri terhadap isolat Staphylococcus aureus dengan diameter rata-rata zona hambat 9,25 mm, 13,50 mm, 15,37 mm, 20,00 mm dan 20,25 mm. Hasil analisis data dengan ANOVA dilanjutkan uji Duncan (P < 0,05) menunjukkan berbagai konsentrasi minyak atsiri kulit buah jeruk nipis memiliki pengaruh yang nyata dalam menghambat pertumbuhan isolat Staphylococcus aureus secara in vitro. Kata kunci: Minyak atsiri, Citrus aurantifolia, Staphylococcus aureus.