Kakao (Theobroma cacao L.) merupakan salah satu spesies tumbuhan tropis yang memiliki keragaman yang tinggi, baik bentuk buah, warna buah, besar biji, ketahanannya terhadap hama dan penyakit maupun genetiknya. Kandungan polisakarida dan polifenol yang tinggi pada kakao dapat menurunkan kualitas dan kuantitas DNA yang diperoleh. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk melihat pengaruh lama perendaman dan jenis pelarut terhadap kemurnian dan konsentrasi isolat DNA kakao. Sampel diambil dari satu pohon kakao (Theobroma cacao L.) di Darussalam, Banda Aceh. Isolasi sampel dan gel documentation dilakukan di Laboratorium Biologi Sel dan Molekuler Jurusan Biologi FMIPA Universitas Syiah Kuala. Spektrofotometri sampel dilakukan di Loka Litbang Biomedis Dinas Kesehatan Aceh. Elektroforesis gel dilakukan di UPTD Laboratorium Veteriner Dinas Kesehatan Hewan dan Peternakan Aceh. Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Maret hingga Agustus 2015. Sampel direndam dalam 500 mL pelarut dalam cawan petri selama 7 hari. Pelarut yang digunakan adalah metanol 96%, metanol 75%, metanol 50%, etanol 96%, etanol 75%, etanol 50%, dan akuades. Isolasi sampel dilakukan berdasarkan metode Zheng (1995). Isolat DNA diukur kemurnian dan konsentrasinya menggunakan nanofotometer dengan panjang gelombang A260/A280. Sampel dielektroforesis pada 1% gel agarosa dalam 1x TBE dengan kuat arus 50 V selama 45-60 menit. Kemurnian DNA terbaik diperoleh dari sampel yang direndam dengan metanol 96% selama 2 hari (A260/A280 = 1,77). Konsentrasi DNA tertinggi didapat dari sampel yang direndam dengan etanol 96% selama 1 hari (446,33 ng/µL). Kata kunci: Kakao (Theobroma cacao L.), isolasi DNA, polifenol, optimasi, pelarut