Biji jintan hitam (Nigella sativa Linn) dikenal sebagai tanaman obat tradisional yang baik di Indonesia. Biji jintan hitam (Nigella sativa Linn) merupakan obat tradisional yang sering digunakan pada pasien diare, dan dapat digunakan sebagai antibakteri. Escherichia coli merupakan salah satu bakteri penyebab infeksi diare. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui daya hambat ekstrak etanol biji jintan hitam dalam menghambat pertumbuhan Escherichia coli secara In Vitro. Penelitian menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) terbagi dalam 6 kelompok perlakuan, yaitu dengan 4 kelompok perlakuan dan 2 kelompok kontrol, dengan pengulangan sebanyak 4 kali. Kelompok perlakuan terdiri dari ekstrak etanol biji jintan hitam yang dibagi dalam konsentrasi 40%, 60%, 80%, 100%. Kelompok kontrol positif diberikan antibiotik Kloramfenikol dan kelompok kontrol negatif diberikan Carboxyl Methyl Cellulose (CMC) 1%. Data dianalisis menggunakan Analysis of Variance (ANOVA) dan dilanjutkan dengan Uji BNT (Beda Nyata Terkecil). Hasil uji ANOVA dan BNT diperoleh bahwa ekstrak etanol biji jintan hitam dengan konsentrasi 40%, 60%, 80%, dan 100% dapat menghambat pertumbuhan Escherichia coli secara in vitro dan semakin tinggi konsentrasi ekstrak maka semakin besar daya hambat yang didapatkan. Konsentrasi paling efektif pada ekstrak etanol biji jintan hitam (Nigella sativa L.) yaitu pada konsentrasi 100% dengan zona hambat 9,75 mm. Kata kunci : Biji jintan hitam, Escherichia coli, ekstrak etanol.