Penelitian ini bertujuan untuk memvalidasi kit ELISA testosteron komersial (EIA-1559, DRG Instruments, GmbH) secara analitik dan biologis dalam menentukan konsentrasi hormon testosteron pada kambing kacang. Penelitian ini menggunakan 18 ekor kambing kacang yang sehat dari peternakan rakyat Desa Lamreeh terdiri dari 6 ekor jantan dewasa (>2 tahun), 6 ekor jantan anak (2 tahun atau sudah beranak). Sampel darah diambil dari vena jugularis dan dipreparasi menjadi serum. Lalu disimpan pada suhu -20o C sampai dilakukan analisis hormon. Pada penelitian ini dilakukan dua uji validasi yaitu validasi analitik (uji parallelism, akurasi, sensitivitas, dan presisi) dan uji validasi biologis. Pengukuran konsentrasi testosteron pada serum menggunakan metode Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Data hasil uji validasi analitik dianalisis secara deskriptif, sedangkan hasil validasi biologis dianalisis menggunakan sidik ragam (ANOVA). Hasil validasi analitik menunjukan bahwa pada uji parallelism kurva sampel sejajar dengan kurva standar, akurasi kit komersial ELISA yang digunakan sebesar 92-106% dan sensitivitas yaitu 0,083 ng/ml. Presisi diukur dengan menghitung koefisien variasi (CV) intra assay dan inter assay dari QC1 (high quality control) dan QC2 (low quality control) yang digunakan. Hasil penelitian diperoleh %CV intra assay Q1 dan Q2 sebesar 6,8% dan 4,75% sedangkan %CV inter assay Q1 dan Q2 sebesar 8,4% dan 6,7%. Hasil uji validasi biologis menunjukkan bahwa konsentrasi hormon testosteron pada jantan dewasa lebih tinggi (P